KLV大学分光コース

分光分析におけるスペクトル測定のコツ

スペクトル測定では透明で安定したサンプルだけではなく色が付いたもの、濁っているもの、粉体・固体・液体・気体状のもの、不均一なもの、温度変化があるものなど状態は様々です。

そのため、それらに合わせた手法を選び条件を準備する必要があります。
本記事では、そのスペクトル測定のコツを測定ステップに沿ってご紹介します。

スペクトル測定の４つのステップ

Step1測定方法を選ぶ

スペクトル測定の基本の流れは以下です。

リファレンスとなる透過光または反射光の強度（I0）を測定する
目的のサンプルをセットして光強度（I1）を測定する
2つの強度の差から吸光度を求める

この時、測定対象によって適切な光と資料（リファレンスやサンプル）の位置関係が存在します。
以下に代表的な測定方法を紹介します。

・透過法（Transmittance）

光が通る経路にサンプルを置き、吸光度を測定するシンプルな方法です。
主に透明なサンプルのスペクトル測定に使用されます。
分光分析の基礎である「ランベルト・ベールの法則」が適用できる場合が多いです。
検出できる光の強度はサンプルの厚みや濃度によって変わるので、十分な強度が得られるようにサンプルの厚みを調節したり最適な透過セルの長さを選ぶ必要があります。

→「透過測定とは」透過測定の原理やメリット、導入事例など詳しくご説明します。

拡散反射法（Diffuse Reflectance）

サンプルに光を当て、反射した光を検出し吸光度を測定する方法です。
濁ったものや、粉体・固体などの不透明なサンプルのスペクトル測定に使用されています。
入射した光はサンプルへ入り、内部で散乱・屈折・吸収を繰り返し、一部の光が外にでるためそれを検出します。
サンプルの表面から正反射した光には吸収による情報があまり含まれていないため、光の入射角と検出器の確度をずらす等の工夫が必要です。
拡散反射光はあらゆる方向へ散乱するため、積分球を使って集めることもあります。

→「拡散反射法とは」透過測定の原理やメリット、導入事例など詳しくご説明します。

全反射測定法/ATR法（Attenuated Total Reflectance）

クリスタル内を透過する赤外線の光を、クリスタルとサンプルの接地面で全反射させて、その反射光を検出し吸光度を測定する方法です。
透明度に限らず粉体・固体・液体のサンプルのスペクトル測定に使用されています。
赤外線の光はクリスタルとサンプルの界面で全反射する時に少しサンプルへ潜り込むため、サンプル表面のスペクトルを測定することができます。
この方法を活用するためにはクリスタルとサンプルが接触していることが条件になりますので、隙間や気泡などがないことを確認しましょう。

→「全反射測定法(ATR法)とは」透過測定の原理やメリット、導入事例など詳しくご説明します。

Step2光路長を最適化する

「ランベルト・ベールの法則」は光の物質による吸収を定式化した法則で、光をサンプルに透過させるとサンプルの濃度により透過した光のエネルギーが減少すること、透過する距離によって光のエネルギーが減少することを示しています。

ランベルト・ベールの公式

A = - \log_{10} (\frac{I}{I_{0}}) = E C l

$A$ ：吸光度

$E$ ：比吸光度

$C$ ：サンプル濃度

$l$ ：光路長

この公式から、光が透過する距離を一定にすると吸光度とサンプル濃度は比例するため、吸光度からサンプルの濃度を算出することが可能であることがわかります。
「ランベルト・ベールの法則」はある範囲内では直線性を保っていますが、有効範囲から外れてしまうと、サンプルの濃度と吸光度の相関性がズレてしまい有効な解析ができないとされるため、一般的に吸光度は「0.1以上1以内」が望ましいと言われています。

そのため、サンプルの厚みや透過セルの距離（光路長）を最適化し、吸光度の範囲を条件に合わせることが求められます。
液体サンプルを測る透過セルの場合は光路長が異なった種類が販売されていますので簡単に入手することが可能です。

Step3リファレンスを選ぶ

リファレンスはサンプルの透過光・反射光と比較するために使用される基準となる光です。
リファレンスはスペクトル測定を正確に且つ安定的に行うために重要です。

透明なサンプルのリファレンス

透明なサンプルを測定する場合は、「ランベルト・ベールの法則」に基づき透過法にて吸収成分を見ることができますので、それに合ったリファレンスを選びます。
例えば透明なフィルムやプラスチックのような固体、形態が固定されているものを測定する時は、なにもない空間を通った光をそのままリファレンスとして測定します。
溶液のサンプルの濃度を定量測定する時は、目的の成分が含まれていない溶媒のみを入れた透過セルをリファレンスとして測定します。
ただし、溶媒自体の光の吸収が変化するとリファレンスとしては使いにくいので、空の透過セルをリファレンスとして測定することがあります。
透過セルの吸収が強い場合は、予め空の透過セルの吸光度を測定し、後からサンプルの入った透過セルのスペクトルから差し引くこともできます。

※透過セルを使って測定する場合は、透過セルの材質、光路長、厚みをリファレンスとサンプルの測定時で合わせる必要があります。

不透明なサンプルのリファレンス

拡散反射法を使い不透明なサンプルを測定する場合は、目的の吸収成分に注目するために関係のない散乱成分はなるべく排除することが重要です。
不透明なサンプルのリファレンスは、サンプルと同程度の散乱係数を持ち、目的の波長範囲において光の吸収がないものが理想的です。
近赤外線を使った分光分析では、PTFEやセラミック板などが使用されています。
また、スペクトラロン®のように散乱係数が調整されたフッ素樹脂の標準反射板は反射プロファイルが既に提供されていますので、拡散反射法のリファレンスとして使用しやすいです。

Step4サンプルの条件を揃える

サンプルの条件を揃えることでよりスペクトル測定が正確且つ安定します。

サンプルの形状・サイズ、表面の状態によっては、光が当たった時の散乱が変化し光の吸収強度が変動してしまう可能性があります。
例えば粉体状のサンプルになりますと、粒のひとつひとつの大きさや粉の密度や均一性によって散乱は変化します。
スペクトル測定をする時は事前にサンプルをサイズを統一したり、セルを使う場合は均一に敷き詰めたりすることでなるべく散乱による影響を少なくするなどの工夫も有効です。

また、サンプルによっては温度の変化によりスペクトルが変化します。
代表的なものとしては水や水素結合のある分子が挙げられます。
水は温度の変化によりスペクトルが変化してしまうため、水分が含まれるサンプルを測定する時は温度制御を推奨します。