-お客様の声-
顕微鏡の品質管理ツール　ARGOSLIDE

京都大学大学院 生命科学研究科・医学研究科
松田研究室

Argolight社が蛍光顕微鏡用の新しい品質管理ツールとして提供しているアルゴスライド（ARGOSLIDE）。

Interview

研究室ご紹介

　　

ご所属	京都大学大学院　生命科学研究科・生体制御学/医学研究科・病態生物医学 松田研究室
研究テーマ	蛍光生体イメージングの技術で「誰も見たことがない現象を発見」し、システム生物学の手法を使って「さまざまな病態の理解」を目指す。
研究室WEBサイト	http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp
研究施設	京都大学 大学院 生命科学研究科 生命動態 共用研究施設 https://www.lif.kyoto-u.ac.jp/dynamiclivingsystems/

ご研究内容について教えて頂けますでしょうか。

寺井様：私たち松田研究室では「顕微鏡を使った蛍光生体イメージング」を行っています。

蛍光タンパクは、ある種のタンパク質をラベリングして、それが動いているかどうかを見るために1990年後半から使われてきたものですが、 2000年頃からFRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）が現れ、分子の相互作用を検出できるようになりました。

顕微鏡は松田研究室のメインツールとなっているんですね。

顕微鏡に対する課題

研究室のメインツールである顕微鏡に対して、どのような悩みや課題を抱かれていたか教えて頂けないでしょうか。

寺井様：最も典型的な課題は、「共焦点のフラットネス」です。

不定形な細胞を観察している限り、同一平面をちゃんと出しているかどうか、ということを認識するのは難しいだろうという事です。細胞は不定形で、定型なものを観察したことが無い故に、どのくらいの同一平面を出せているのか判らなかったという典型例ですね。

あとは今でも解決でいていないのは「収差」です。
原因は「球面収差」もしくは「レーザーの照射ムラ」など幾つかあって特定できていないのですが、
「励起光が均一に照射されていない」ということを「定量的に」示したい、このことを何とかしたかったのです。

アルゴスライドを知ったきっかけ

アルゴスライドを知ったきっかけ、経緯を教えて頂けますでしょうか。

寺井様：同研究室の松田教授がどこかの学会で聞きつけてきました（笑）。それで、松田先生から
「これ（アルゴスライド）を試してみないか？」
というところからアルゴスライドの存在を知ったのです。
松田先生も研究室のメンバーもそうなんですけど、“新しいものは取りあえず飛びつこう”と。　
松田先生のポリシーとして“最新鋭の機械を使って最新鋭の研究が出来る”ということは、それなりのリスクを負わないといけないんだよ。最新鋭の機器をまずは使ってみる、そして、価値あるものか、使えないものか、あるいは課題があるものかを判断をする”ということも我々の仕事である”というものがあります。

我々とすれば新しくて尖ったものを取り扱う商社の立場なので、その点はとても有難いです。

アルゴスライドを使ってみて

先程お話頂いた明るさなどの課題がある中で、実際にアルゴスライドを使用してみた感想を教えて頂けますでしょうか。

長波長領域での使用

長波長領域での使用は難しいのかなと感じています。私は「FRETバイオセンサー」でレシオイメージングを研究していて、CyanとYellowなど2色の蛍光を見て、その蛍光強度比から分子の活性状態を類推するということを行っています。

従来は、Cyan、Yellowなど短波長領域のものが主でしたが、最近では私が開発したOrange、Far-redといった、従来よりも長波長のものも使っています。長波長域の各チャネルで蛍光強度の平坦性が両者で異なると、視野内で蛍光強度比が違ってしまいます。これを補正したいと思っていました。

ですが、Orange (Ex: 546-566 nm, Em: 573-607 nm)では励起光の光量を最大にして10秒露光しても全く見えなくて…。同じ励起でFar-redでも観察しましたが、かすかに見える程度…。

波長による明るさの違い

やりたかった「Orange-Far-red領域の補正」というが難しいと感じました。アルゴスライドの説明書を見ると、Orangeは吸収も弱いし、出てくるEmission、量子収率も小さいのかなと思いましたが、将来的な解決は望めるのでしょうか。

アルゴスライドが現在対応している励起波長範囲と発光スペクトルは下図の通りで、励起波長範囲は350～650 nmですが、550 nmよりも長波長の蛍光励起には高感度センサーが必要となります。


現在のアルゴスライドは3世代目の製品（AG03）で、1世代前のおよそ3倍の明るさを実現しております。蛍光の“明るさ”や“長波長領域の蛍光を観察したい”等、のご意見はユーザー様から多く頂いており、Argolight社としては「明るさ」の課題に対して日々改良を行っております。

渡部様：Orange-Far-red領域において十分なS/Nをもって撮影するには、恐らく3倍の明るさでは難しいのではないかなと思っていますので、今後も開発よろしくお願いします。

低倍率の画像の定量

渡部様：次に低倍率で撮影した画像についてご覧ください。
これは10倍のレンズでアルゴスライドの「ARGO-HM」を撮った所です。

倍率によるデータ表示の違い

低倍率での画像の定量は出来ていないのではと感じています。
拡大すると十字があってfield of uniformityが取れているんですが、解析ソフトウェアで見てみると、全然解析出来ていないような結果が出ています。正しくは40倍のようにMAX,Min,Mean等が数字として出てくると思うんですが、10倍には出てこなくて…。ちゃんとこの（リング）位置は特定出来ているのに明るさを定量していないというのはどうしてかなと。
出力されたファイルでは、各点のX,Y座標と明るさの情報は取得できているので、ソフトウェア上の表示する機能が正しくないのかな、と。

つまり、解析ソフトウェアでは数字が出ていない状態でも、CSVで確認すると定量された数字が書いてある、ということでしょうか。

渡部様：はい、そうですね。定量されたその数字は見たことがあるのでそこの処理なのかアルゴリズムのところなのかわからないですけど、データは取っています。右下みたいのなものがいつもでるので右上みたいな変なパターンは解析出来ていないだろうなと…。
何らかの数字は出していると思うんですけど、CSVの値から出したのがこの解析結果なのか、ちょっと自信が無くて使えないなって思ってます。

“Field of ring”の分析項目の場合、低倍率の画像では各リングのパラメータは表示されません。これは表示されるリングの数が多過ぎるために起こる現象です。
実際にはどちらの倍率においても同じ計算がされており、分析後のCSVファイルにてリングのパラメータを確認する事が可能です。

資料もご提供頂きありがとうございます。
製品のブラッシュアップのために参考にさせて頂きたいと思います。

アルゴスライドのメリット

アルゴスライドを使用してみて良かった点を教えていただけないでしょうか。

渡部様：平坦性が定量的に比較できるのが凄くありがたいと思いました。

今まではどうやって平坦性を確認してきたかというと、fluorescein（フルオレセイン：蛍光色素の一種）等を溶かした液を観察していました。ただ、この方法だと焦点面以外からの蛍光も強く検出されてしまうため、平坦性を確認するには不十分だと感じていました。
それがアルゴスライドだと焦点面以外からの蛍光が入ることはないため良いと思っています。

外乱光の影響を受けづらいので正確に平坦性が分かるということでしょうか。

はい。正確に平坦性が分かると。

アルゴスライドがもたらす効果

結果の信頼性

「曖昧だった部分が正確に測れる、比較できるようになった」ということは、例えば皆様が出されている研究論文の結果の信頼性が上がるというのがメリットになるのでしょうか。

今までは “はっきり変化するものしか出来なかった。”
でもこれからは
“僅かな変化も自信をもって追えるようになるんじゃないか”と思っています。
私たちが実験をやっている時に“自信をもって言える”というのはすごい大事なんですよ。

営業が「自信を持ってお勧め出来ます。お勧めできる自信の根拠はこういうものです。」というふうに示されると、買う側も好意的に見ることができます。同様に、「正誤をちゃんと調べて、こういう可能性は排除してます。」とすると、自信を持って話すことができる。「ただ単に自分で自信を持てば…」ということではなくて、いわゆる僕らサイエンティストたちは、実験に基づいて、結果に基づいて、自信を持って言えることは、プライスレスに近い大きな価値になります。

Argolight社に期待すること

その他にも何か今後のご要望についてお聞かせ頂けないでしょうか。

寺井様：個人的にはPSFが測れるものが欲しいです。

PSFが測れるものが欲しいというご要望は、非常に多くのお客様から頂いているのですが、現状はアルゴスライドのスライドパターンを描く時の技術的な問題で「点」を描くことが難しく、いわゆる「リング」が限界で、それをいかに小さく作るかということで点に近づけるという状況です。

現状ではPSFはビーズで測っていますか？
ビーズの再現性が明るさ的にも大きさ的にも再現性がないからあまり使えないということでしょうか。

寺井様：そうですね、ビースは5～6 μm、もしくは800～900 nmのような表現で書かれていて、“実測値でちょうど800 nmです”とは書かれていないので、大きさを測るとは言ってもざっくり出すような感じです。
特に二光子顕微鏡や共焦点顕微鏡に関しては、もし自分達の手でPSFをラボで測れるようになったら、PSFがぼやけてきたとか軸がずれてきているということにも気付けるようになるので有難いですね。

貴重なご意見を頂きありがとうございました。今後のアルゴスライドの製品開発に生かしていけるようArgolight社にフィードバックさせて頂きます。